კორონავირუსის რეპლიკაცია-ტრანსკრიფციის კომპლექსი: NiRAN-RdRp ქვედანაყოფების მნიშვნელოვანი და შერჩევითი NMPylation კონსერვაციულ უბნებზე nsp9-ში

რედაქტირებულია პიტერ სარნოუს მიერ, სტენფორდის უნივერსიტეტის მედიცინის სკოლა, სტენფორდის უნივერსიტეტი, კალიფორნია, დამტკიცებულია 2020 წლის 25 დეკემბერს (განხილულია 2020 წლის 25 ოქტომბერს)

ჩვენ ვახსენებთ ქვეერთეულებს შორის ურთიერთქმედებას კოროვირუსები-ტრანსკრიფციის კომპლექსების რეპლიკაციაში, რომლებიც აუცილებელია რეპლიკაციისა და ევოლუციური კონსერვაციისთვის.ჩვენ მივაწოდეთ მტკიცებულება, რომ nsp12-თან ასოცირებულ NiRAN დომენს აქვს ნუკლეოზიდური მონოფოსფატის (NMP) ტრანსფერაზას აქტივობა ტრანსში და მის სამიზნედ დავადგინეთ nsp9 (რნმ-ის დამაკავშირებელი ცილა).NiRAN აკატალიზებს NMP ნაწილის კოვალენტურ მიმაგრებას შენარჩუნებულ nsp9 ამინო ტერმინალთან რეაქციაში, რომელიც ეყრდნობა Mn2+ იონებს და მიმდებარე კონსერვაციულ Asn ნარჩენებს.გაირკვა, რომ NiRAN აქტივობა და nsp9 NMPylation აუცილებელია კორონავირუსის რეპლიკაციისთვის.მონაცემები გვაძლევს საშუალებას დავუკავშიროთ ჩადგმული ვირუსის ფერმენტის მარკერის ეს აქტივობა წინა დაკვირვებებს ჰიპოთეზაში, რომ რნმ-ის სინთეზის დაწყება რნმ ვირუსების კლასში ფუნქციურად და ევოლუციურად თანმიმდევრულია.

Nidovirales-ის რნმ-დამოკიდებული რნმ პოლიმერაზა (RdRps) (Coronaviridae, Arterioviridae და 12 სხვა ოჯახი) დაკავშირებულია ამინოტერმინალურ (N-ტერმინალურ) დომენთან პოლიპროტეინიდან გამოთავისუფლებულ არასტრუქტურულ ცილაში (nsp), სახელწოდებით NiRAN. 1ab შედგება ვირუსული ძირითადი პროტეაზასგან (Mpro).ადრე მოხსენებული იყო არტერიული ვირუსის NiRAN-RdRp nsp-ის საკუთარი GMPylation/UMPylation აქტივობა და ვარაუდობდნენ, რომ წარმოქმნილიყო გარდამავალი ნუკლეოზიდის მონოფოსფატის (NMP) გადასატანად (ამჟამად უცნობი) ვირუსზე და/ან უჯრედის ბიოპოლიმერიზაციის საგნებზე.აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ კორონავირუსს (ადამიანის კორონავირუსი [HCoV]-229E და მძიმე მწვავე რესპირატორული სინდრომი კორონავირუსი 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) აქვს Mn2+-ზე დამოკიდებული NMPylation აქტივობა, რომელიც მიღებულია nsp9-დან Mpro-შუამავლობითი nsp9 ფორმირების შემდეგ. N-ტერმინალის ფლანგური nsps პროტეოლიზურად გამოთავისუფლდება, ფოსფორამიდატი მიბმულია პირველად ამინთან (N3825) nsp9-ის N-ტერმინალთან.ურიდინ ტრიფოსფატი არის სასურველი ნუკლეოტიდი ამ რეაქციაში, მაგრამ ადენოზინტრიფოსფატი, გუანოზინტრიფოსფატი და ციტიდინტრიფოსფატი ასევე შესაფერისი სუბსტრატებია.მუტაციური კვლევები რეკომბინანტული კორონავირუსის nsp9 და nsp12 პროტეინებისა და გენეტიკურად ინჟინერირებული HCoV-229E მუტანტების გამოყენებით განსაზღვრეს ნარჩენები, რომლებიც აუცილებელია NiRAN-ის შუამავლობით nsp9 NMPylation და ვირუსის რეპლიკაციისთვის უჯრედულ კულტურაში.მონაცემებმა დაადასტურა NiRAN აქტიური ადგილის ნარჩენების პროგნოზირება და განსაზღვრა nsp9 N3826 ნარჩენების მნიშვნელოვანი როლი nsp9 NMPylation და ვირუსის რეპლიკაციაში in vitro.ეს ნარჩენი არის კონსერვირებული N-ტერმინალური NNE ტრიპეპტიდური თანმიმდევრობის ნაწილი და აღმოჩნდა, რომ არის nsp9-ისა და მისი ჰომოლოგების ერთადერთი უცვლელი ნარჩენი კოროვირუსების ოჯახში.ეს კვლევა იძლევა მყარ საფუძველს სხვა ბუდობრივი ვირუსების NMPylation აქტივობის ფუნქციური შესწავლისთვის და გვთავაზობს შესაძლო მიზნებს ანტივირუსული პრეპარატების განვითარებისათვის.

Nidovirales დადებით-ჯაჭვიანი რნმ ვირუსი აინფიცირებს ხერხემლიანთა და უხერხემლოების მრავალფეროვნებას (1, 2).ბრძანება ამჟამად მოიცავს 14 ოჯახს (3), რომელთაგან ბოლო 20 წლის განმავლობაში კორონავირუსის ოჯახი ინტენსიურად იქნა შესწავლილი.იმ დროს სამი ზოონოზური კოროვირუსი გაჩნდა ცხოველთა მასპინძლებიდან და გამოიწვია ადამიანებში მძიმე რესპირატორული ინფექციების ფართომასშტაბიანი გავრცელება.მწვავე მწვავე ინფექციური დაავადებებით გამოწვეული მდგრადი პანდემიების ჩათვლით.რესპირატორული სინდრომი Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).ნიდოვირუსებს აქვთ საერთო გენომის ორგანიზაცია და მემბრანულად შეკრული რეპლიკაცია-ტრანსკრიფციის კომპლექსის (RTC) ქვეერთეული დაშიფრულია 5-?²-ტერმინალის ორ მესამედში და ვირუსის ნაწილაკების მთავარ სტრუქტურულ ქვედანაყოფში, ასევე ზოგიერთ აქსესუარში. .პროტეინი, კოდირებული გენომის 3?2 ბოლო მესამედში (1).გარდა პლანარული ვირუსების ერთი ოჯახისა (Monoviridae) (8), ყველა ჩასმული ვირუსი კოდირებს RTC ქვედანაყოფებს ორ დიდ ღია კითხვის ჩარჩოებში (ORF) ORF1a და ORF1b, რომლებიც ითარგმნება გენომიური რნმ-დან.ORF1a აკოდირებს პოლიპროტეინს (pp) 1a, ხოლო ORF1a და ORF1b ერთობლივად კოდირებს pp1ab.ძირითადი პროტეაზას (Mpro) ზოგადი მონაწილეობით, რომელიც კოდირებულია ORF1a-ით, ორივე pp1a და pp1ab პროტეოლიზურად მუშავდება მრავალფეროვან არასტრუქტურულ ცილებად (nsps), ასევე ცნობილი როგორც 3CLpro, რადგან მას აქვს ჰომოლოგია პიკორნავირუსის 3Cpro-სთან ( 9).ითვლება, რომ ეს NSPS იკრიბება დიდ დინამიურ RTC-ში, ახდენს გენომიური რნმ-ის (რეპლიკაცია) და ქვეგენომიური რნმ-ის ნაკრების (ტრანსკრიფცია) სინთეზის კატალიზებას და გამოიყენება ORF1b-ის ქვემოთ მდებარე ORF-ის გამოხატვის კოორდინირებისთვის (10?? ?12).

ბირთვის RTC მოიცავს რნმ-დამოკიდებულ რნმ პოლიმერაზას (RdRp) (13), სუპეროჯახის 1 ჰელიკაზას (HEL1) (14, 15) და რამდენიმე რნმ-ის გადამამუშავებელ ფერმენტს, რომლებიც ძირითადად კოდირებულია ORF1b-ში და კოროვირუსების ოჯახში. შეიცავს nsp12-nsp16 და nsp9-nsp12 Arterioviridae ოჯახში (იხ. მითითება 10ââ 12).RdRp და HEL1 წარმოადგენს ფრინველის ბუდის ვირუსის ორ (ერთ მეხუთედ) შენახულ დომენს და აქვთ ჰომოლოგია სხვა რნმ ვირუსებს შორის.ითვლება, რომ ბირთვის რეპლიკაზას ეხმარება სხვა ქვედანაყოფები, მათ შორის რამდენიმე პატარა NSPS, რომელიც გამოიყოფა pp1a-ს კარბოქსი-ტერმინალური (C-ტერმინალური) რეგიონიდან, Mpro-ს ქვემოთ (კორონავირუსი nsp5 და არტერიული ვირუსი nsp4, შესაბამისად).მათ აქვთ შეზღუდული ოჯახური დაცვა და მრავალფეროვანი აქტივობები (განხილულია მითითებაში 10ââ12).

შედარებით ცოტა ხნის წინ, დომენი, რომელსაც აქვს უნიკალური თანმიმდევრობის მოტივის მახასიათებლები, ნაპოვნი იქნა RdRp-ის მიმდებარე ამინო ტერმინალზე (N-ტერმინალი) ყველა ჩადგმულ ვირუსში, მაგრამ არა სხვა რნმ ვირუსებში (16).მისი მდებარეობისა და ნუკლეოტიდური ტრანსფერაზას (ნუკლეოზიდური მონოფოსფატი [NMP] ტრანსფერაზა) აქტივობიდან გამომდინარე, ამ დომენს ეწოდება NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).NiRAN-RdRp-ის ორდომენიანი კომბინაცია წარმოადგენს nsp12-ს Coronaviridae-ს ოჯახში და nsp9-ს Arterioviridae-ში, ხოლო სხვა ნესტოვირიდებში, NiRAN-RdRp, სავარაუდოდ, გამოიყოფა როგორც დამოუკიდებელი nsp ვირუსული პოლიპროტეინისგან.კორონავირუსში, NiRAN დომენი შეიცავს ??1/450 ნარჩენებს და დაკავშირებულია C-ტერმინალის RdRp დომენთან დამაკავშირებელი რეგიონის მეშვეობით (16?19).ცხენის არტერიტის ვირუსში (EAV) (Arteriviridae), რეკომბინანტული nsp9 გვიჩვენებს Mn2+ იონზე დამოკიდებულ (თვითონ) UMPylation და GMPylation აქტივობებს, რომლებიც დამოკიდებულია ნესტოვირუსში, AN, BN და CN ნარჩენებზე ნესტოვირუსში, AN, BN და CN კონსერვაციაზე.სადაც N ნიშნავს NiRAN) (16).ამ მოტივების N-ტერმინალური ფლანგინგი არის ნაკლებად კონსერვატიული მოტივი preAN.ამ ნარჩენებიდან ზოგიერთი ასევე დაცულია შორეულ მონათესავე პროტეინ კინაზებში, სადაც ნაჩვენებია, რომ ისინი მონაწილეობენ ნუკლეოზიდის ტრიფოსფატის (NTP) შეკავშირებაში და კატალიზურ აქტივობაში (20, 21).ამ დაკვირვების შესაბამისად, ფსევდოკინაზას SelO-ს რამდენიმე ძირითადი ნარჩენი Pseudomonas syringae-დან შეიძლება აწყობილი იყოს ახლახან გამოქვეყნებული SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 სუპერკომპლექსით.კონსერვირებული Coronavirus NiRAN-ის ნარჩენები ელექტრონულ მიკროსტრუქტურაშია.რეკომბინანტული ცილა (17).ვარაუდობენ, რომ დოკუმენტირებული (თვით) U/GMPylation წარმოქმნის გარდამავალ მდგომარეობას NMP-ის გადასატანად (ამჟამად უცნობი) სუბსტრატზე (16), და სტრუქტურული მსგავსება NiRAN-სა და პროტეინ კინაზას (17, 19) შორის არის ჰიპოთეზა, რომ NiRAN ცვლის სხვა ცილებს.

მრავალი მახასიათებელი, მათ შორის მისი უნიკალური და უნიკალური სისტემატური ასოციაცია ბუდებულ ვირუსებთან და გენეტიკური განცალკევება RdRp-ისგან, აქცევს NiRAN-ს გონივრულ საკვანძო მარეგულირებელ ფერმენტად ჩადგმული ვირუსებისთვის, რაც გადამწყვეტია მათი გაჩენისა და იდენტობისთვის.ადრე იყო მოწოდებული სამი შესაძლო ფუნქცია, რომელიც მოიცავს NiRAN-ს გენომის/ქვეგენომიური თარგმანის ან რეპლიკაციის/ტრანსკრიფციის რეგულირებისთვის.იმ დროისთვის არსებული მწირი და არასრული მონაცემების გათვალისწინებით, თითოეულ ფუნქციას აქვს თავისი დადებითი და უარყოფითი მხარეები (16).ამ კვლევაში, ჩვენ მიზნად ისახავს გავაერთიანოთ ორი გვარის კოროვირუსების ბიოქიმიური და საპირისპირო გენეტიკური კვლევები და დავაყენოთ ჩვენი აღმოჩენები კოროვირუსების ოჯახის ბუნებრივი მუტაციის ევოლუციურ ფონზე, რათა მივიღოთ ინფორმაცია ამ იდუმალი სფეროს შესახებ.ჩვენ ვახსენებთ ძირითად მიღწევებს NiRAN-ის გაგებაში RTC-ში ბუნებრივი სამიზნეების იდენტიფიკაციის გზით, რაც (სამ არსებულ ჰიპოთეზას შორის) ხელს უწყობს ამ დომენის როლს შიგთავსი ვირუსის რნმ-ის სინთეზის ინიცირებაში.ეს კვლევა ასევე ხსნის შესაძლებლობებს NiRAN-ის სხვა როლებისთვის ვირუსის მასპინძლის ინტერფეისზე.

კორონა ვირუსის nsp12-თან დაკავშირებული NiRAN დომენის ფერმენტული თვისებების დასახასიათებლად, ჩვენ შევქმენით ადამიანის კორონავირუსის 229E (HCoV-229E) nsp12 რეკომბინანტული ფორმა E. coli-ში, His6 ტეგით C-ბოლოზე და გავაერთიანეთ პროტეინი [α32-P]-ით ინკუბირება NTP-თან ერთად MnCl2-ის თანდასწრებით, როგორც აღწერილია მასალები და მეთოდები.რეაქციის პროდუქტის ანალიზმა აჩვენა რადიოეტიკეტირებული პროტეინის არსებობა, რომელიც თანამიგრირებულია nsp12-თან (106 kDa), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ კორონავირუსი nsp12 კატალიზებს კოვალენტური ცილა-NMP დანამატების წარმოქმნას, უპირატესად წარმოქმნილი ურიდინის მონოფოსფატით (UMP) (სურათი 1A) და ბ).რაოდენობრივმა ანალიზმა აჩვენა, რომ სხვა ნუკლეოტიდებთან შედარებით, UMP-ის ინკორპორაციის სიგნალის ინტენსივობა გაიზარდა 2-დან 3-ჯერ (სურათი 1C).ეს მონაცემები შეესაბამება კორონავირუსის NiRAN დომენის NMP ტრანსფერაზას პროგნოზირებულ აქტივობას (16), მაგრამ მიუთითებს იმაზე, რომ კოროვირუსის NiRAN დომენის ნუკლეოტიდური პრეფერენციები და არტერიული ვირუსი განსხვავებულია.

HCoV-229E nsp12-ის თვით-NMPylation აქტივობა.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ინკუბირებული იყო დანიშნული [α-32P] NTP 6 მმ MnCl2-ის თანდასწრებით 30 წუთის განმავლობაში (იხილეთ მასალები და მეთოდები დეტალებისთვის).რეაქციის პროდუქტები გამოეყო SDS-PAGE-ით და შეიღება Coomassie ბრწყინვალე ლურჯით.(B) რადიო მარკირებული ცილა ვიზუალიზდება ფოსფორის გამოსახულების საშუალებით.nsp12-His6 და ცილის მოლეკულური მასის მარკერების პოზიციები (კილოდალტონებში) ნაჩვენებია A და B-ში. (C) რადიოაქტიური სიგნალის ინტენსივობა (საშუალო ± SEM) განისაზღვრა სამი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან.*P≤0.05.სიგნალის სიძლიერე (პროცენტი) დაკავშირებულია UTP-თან.

მიუხედავად იმისა, რომ ნაჩვენებია, რომ NiRAN-თან დაკავშირებული ფერმენტის აქტივობა აუცილებელია EAV-ისა და SARS-CoV-ის რეპლიკაციისთვის უჯრედულ კულტურაში (16), NiRAN-ის სპეციფიკური ფუნქცია და პოტენციური სამიზნეები ჯერ არ არის განსაზღვრული.ახლახან მოხსენებულმა სტრუქტურულმა მსგავსებამ NiRAN-სა და პროტეინ-კინაზას მსგავსი ნაკეცების მქონე პროტეინების ოჯახს შორის (17, 22) აიძულა შეგვემოწმებინა ჰიპოთეზა, რომ NiRAN კატალიზებს სხვა ცილების NMPylation-ს.ჩვენ შევქმენით პოტენციური ჰომოლოგიური სამიზნეების ნაკრები, მათ შორის არასტრუქტურული ცილები, რომლებიც კოდირებულია HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), თითოეული შეიცავს C-ტერმინალის His6 ტეგს (SI დანართი, ცხრილი S1) და ამ ცილების ინკუბირება [α32-P] ურიდინ ტრიფოსფატით ([α32-P]UTP) nsp12-ის თანდასწრებით ან არარსებობით.მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინი და MBP-LacZα შერწყმული ცილა, წარმოებული E. coli-ში ემსახურებოდა როგორც საკონტროლო (სურათი 2A, ხაზები 1-დან 7-მდე).რადიო მარკირებული ცილა გაანალიზდა ნატრიუმის დოდეცილსულფატ-პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით (SDS-PAGE) და ავტორადიოგრაფიით, და აღმოჩნდა, რომ იყო ძლიერი რადიოაქტიური სიგნალი nsp12 და nsp9 შემცველი რეაქციაში.სიგნალის პოზიცია შეესაბამება nsp9-ის მოლეკულურ მასას, რაც მიუთითებს nsp9-ის nsp12 შუამავლობით UMPylation (სურათი 2B, ბილიკი 7).სხვა სატესტო ცილა არ აღმოჩნდა UMPylated, რამაც მიგვიყვანა დასკვნამდე, რომ nsp9 არის nsp12-ის სპეციფიკური სუბსტრატი.1-ში ნაჩვენები თვით-NMPylation მონაცემებთან შესაბამისობაში, nsp12-ს შეუძლია ოთხივე NMP-ის გადატანა nsp9-ზე, თუმცა ეფექტურობა განსხვავებულია, UMP> ადენოზინმონოფოსფატი (AMP)> გუანოზინმონოფოსფატი (GMP)> ციტიდინ მონოფოსფატი (CMP)) Სურათი).3 A და B).ამ ანალიზში გამოყენებულ პირობებში (შემოკლება რეაქციისა და ექსპოზიციის დროის შემცირება, nsp12-ის კონცენტრაციის შემცირება; მასალები და მეთოდები), nsp12-ის თვით-NMPylation ვერ გამოვლინდა (შეადარეთ სურათი 2B, ხაზი 7 და სურათი 1B), რაც აღმოჩნდა ეფექტური (და მრავალი რაუნდი) UMP გადავიდა nsp12-დან nsp9-ზე.UMP ტრანსფერაზას აქტივობა მოითხოვს Mn2+ იონების არსებობას, როგორც ნაჩვენებია სურათზე 3C, მაშინ როცა მხოლოდ მინიმალური UMP ტრანსფერაზას აქტივობა დაფიქსირდა Mg2+-ის თანდასწრებით და არანაირი აქტივობა სხვა ორი შემოწმებული ორვალენტიანი კატიონის თანდასწრებით.მსგავსი მონაცემები იქნა მიღებული NMPylation ანალიზებში, რომლებიც შეიცავს ციტიდინ ტრიფოსფატს (CTP), გუანოზინტრიფოსფატს (GTP) და ადენოზინტრიფოსფატს (ATP) (SI დანართი, სურათი S1).

HCoV-229E nsp12 შუამავლობით nsp9-ის UMPylation.პროტეინის სუბსტრატების სერია (მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინის ჩათვლით, MBP-lacZα და HCoV-229E nsps-ის სერია, ეტიკეტირებული C-ტერმინალი His6-ით დაშიფრული ORF1a-ით) გამოყენებული იყო HCoV-229E nsp12-His6⁺-მედიალიზებული UMPylation აქტივობის შესაფასებლად. ცილის.პროტეინის ინკუბაცია [α-32P] UTP-ით 10 წუთის განმავლობაში nsp12-ის (A) ან (B) არარსებობის შემთხვევაში, როგორც აღწერილია მასალებსა და მეთოდებში.A და B ზევით ნაჩვენებია SDS-პოლიაკრილამიდის გელი, რომელიც შეღებილია Coomassie Brilliant Blue-ით, ხოლო A და B-ის ბოლოში ნაჩვენებია შესაბამისი ავტორადიოგრამები.ცილის მოლეკულური მასის მარკერის პოზიცია (კილოდალტონებში) მოცემულია მარცხნივ.ასევე მითითებულია nsp12-His6-ის პოზიცია (B, ზევით) და რადიოაქტიური სიგნალი, რომელიც დაფიქსირდა nsp12-His6-ის nsp9-His6-ით (B, ხაზი 7) ინკუბაციის დროს, რაც მიუთითებს, რომ [α-32P]UMP nsp9-His6-მდე (12,9 კდა), რაც არ დაფიქსირებულა სხვა შემოწმებულ ცილებზე.

HCoV-229E NiRAN შუამავლობით nsp9 NMPylation-ის ბიოქიმიური და ვირუსოლოგიური დახასიათება.(A და B) რეაქციაში გამოყენებული ნუკლეოტიდური თანასუბსტრატის როლი.Nsp12-His6 და nsp9-His6 შერეულია და ინკუბირებულია სხვადასხვა [α-32P] NTP-ების თანდასწრებით სტანდარტული NMPylation ანალიზში.(A, ზევით) Coomassie-ით შეღებილი nsp9-His6 გამოყოფილი SDS-PAGE-ით.(A, ქვედა) გელის იმავე უბნის ავტორადიოგრაფი.(B) ფარდობითი აქტივობა (საშუალო ± SEM) დანიშნული ნუკლეოტიდური კოფაქტორის თანდასწრებით განისაზღვრება სამი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან.*P≤0.05.(გ) ლითონის იონების როლი.ნაჩვენებია სტანდარტული NMPylation ტესტი [α-32P] UTP და სხვადასხვა ლითონის იონების თანდასწრებით, თითოეული კონცენტრაციით 1 მმ.C-ში ზემოდან ნაჩვენებია Coomassie-ზე შეღებილი nsp9-His6, ხოლო C-ში ქვედა ნაჩვენებია შესაბამისი ავტორადიოგრაფია.ეტიკეტირებული ცილის ზომა (კილოდალტონებში) ნაჩვენებია A და C-ის მარცხნივ. (D) HCoV-229E nsp12-His6-ის მუტანტური ფორმა, რომელიც ატარებს მითითებულ ამინომჟავის ჩანაცვლებას, არის [α-32P]UTP, როგორც აღწერილია. მასალები და მეთოდები.რადიო მარკირებული nsp9-His6, რომელიც წარმოიქმნება NMPylation რეაქციაში, გამოვლენილია ფოსფორილირების გამოსახულების საშუალებით (D, ზედა).ფარდობითი აქტივობა ველური ტიპის (wt) პროტეინთან შედარებით ნაჩვენებია D-ში, ხოლო ქვედა აღებულია, როგორც საშუალო (±SEM) სამი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან.ვარსკვლავი მიუთითებს არაკონსერვირებული ნარჩენების ჩანაცვლებაზე.(E) ვირუსის ტიტრი p1 უჯრედების კულტურის ზენატანტში, რომელიც მიღებულ იქნა ინფექციიდან 24 საათის შემდეგ, განისაზღვრა დაფების ანალიზით.მითითებულია კოდონის ჩანაცვლება NiRAN დომენში ინჟინერირებული HCoV-229E მუტანტის (ნარჩენების ნუმერაცია ეფუძნება მათ პოზიციას pp1ab-ში).რეპლიკაციის დეფიციტი RdRp აქტიური ადგილის მუტანტი nsp12_DD4823/4AA გამოყენებული იყო როგორც კონტროლი.

NiRAN-ის აქტიური ადგილის უფრო ღრმა გაგების მიზნით და nsp9-სპეციფიკური NMP ტრანსფერაზას აქტივობასთან დაკავშირებული ნარჩენების დასადგენად, ჩვენ ჩავატარეთ მუტაციური ანალიზი, რომელშიც ჩავანაცვლეთ კონსერვატიული ნარჩენები NiRAN AN, BN და CN მოტივებში ( 16) ეს არის Ala (SI დანართი, სურათი S2).გარდა ამისა, კონსერვატიული Arg-to-Lys ან Lys-to-Arg ჩანაცვლების გავლენა შეფასდა ორ შემთხვევაში.როგორც (უარყოფითი) კონტროლი, ნარჩენები, რომლებიც არ არის ან ნაკლებად არის კონსერვირებული კოროვირუსების და სხვა ჩადგმული ვირუსების NiRAN დომენში, ჩანაცვლებულია Ala. BN) და D4280A (CN) მნიშვნელოვნად ამცირებს ან თუნდაც გამორიცხავს nsp9 NMPylation nsp12-ის მეშვეობით, ხოლო ცილები კონსერვატიული შემცვლელებით (R4178K), K4116R) ინარჩუნებენ თავიანთი აქტივობის 60% და 80%-ს, რაც მიუთითებს, რომ შეზღუდვების მოდუნება მათ შესაბამის მხარეზე ჯაჭვები ფიზიკურ-ქიმიურად მგრძნობიარეა (სურათი 3D).რამდენიმე სხვა შენახული ნარჩენების E4145A, D4273A, F4281A და D4283A ჩანაცვლება გაცილებით ნაკლებად საზიანოა და nsp9 UMPylation მხოლოდ ზომიერად მცირდება.მსგავსი შედეგები მიღებულ იქნა nsp9 NMPylation რეაქციებში, რომლებიც მოიცავს სხვა NTP-ებს (სურათი 3D და SI დანართი, სურათი S3), რაც ადასტურებს, რომ დაკვირვებული ეფექტები სპეციფიკურ ამინომჟავების ჩანაცვლებაზე დამოუკიდებელია გამოყენებული ნუკლეოტიდის თანა-სუბსტრატის ტიპისგან.შემდეგ, ჩვენ გამოვცადეთ ამ nsp12 ჩანაცვლების შესაძლო გავლენა უჯრედულ კულტურაში კოროვირუსების რეპლიკაციაზე.ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ შესაბამისი გენეტიკურად ინჟინერირებული დამატებითი დნმ-ის (cDNA) შაბლონები, რომლებიც კლონირებულია რეკომბინანტულ ვაქცინიის ვირუსში (23, 24) 5 -7 უჯრედის ტრანსკრიპტისთვის.ამ უჯრედებში წარმოქმნილი ინფექციური ვირუსის შთამომავლების ტიტრირებამ აჩვენა, რომ HCoV-229E NiRAN მუტანტების უმეტესობა შეუძლებელი იყო (სურათი 3E).არასიცოცხლისუნარიანი ვირუსული მუტანტების ჯგუფი მოიცავს ალტერნატივებს, რომლებიც აღმოფხვრილია ან მნიშვნელოვნად ამცირებს NMP ტრანსფერაზას აქტივობას in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), მაგრამ არსებობს ორი სხვა ალტერნატივა (K4116R, E4814A) % დაჯავშნილი?მათი ინ ვიტრო NMPylation აქტივობა მიუთითებს დამატებით შეზღუდვებზე.ანალოგიურად, ორი სხვა მუტაცია (R4178K, F4281A), რამაც გამოიწვია NiRAN-ის ინ ვიტრო NMPylation აქტივობის ზომიერი დაქვეითება, წარმოქმნა ცოცხალი ვირუსები, თუმცა, ამ ვირუსებმა მნიშვნელოვნად შეამცირეს ტიტრები რეპლიკაციის გზით.სურათი 3D-ში ნაჩვენები in vitro აქტივობის მონაცემებთან შესაბამისობაში, ოთხი სხვა ნარჩენების ჩანაცვლება, რომლებიც არ არის კონსერვირებული კოროვირუსებში და/ან სხვა ჩადგმულ ვირუსებში (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) წარმოქმნა სიცოცხლისუნარიანი ვირუსები. ზომიერად შემცირებული ტიტრი ველური ტიპის ვირუსთან შედარებით (სურათი 3E).

იმის შესასწავლად, დამოკიდებულია თუ არა NiRAN-ის შუამავლობით NMP ტრანსფერაზას აქტივობა აქტიურ RdRp დომენზე, ორი კონსერვირებული Asp ნარჩენი, რომელიც მონაწილეობს ორვალენტიანი ლითონის იონების კოორდინაციაში (11) RdRp მოტივში C ჩანაცვლდა Ala-ით. მიღებული ცილა nsp12_DD4823/4AA ინარჩუნებს მისი nsp9 NMPylation აქტივობა, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ nsp12 შუამავლობით გამოწვეული in vitro nsp9 NMPylation აქტივობა არ საჭიროებს პოლიმერაზას აქტივობას (SI დანართი, სურათი S4).

nsp9-სპეციფიკური NMP ტრანსფერაზას აქტივობის დადგენის შემდეგ nsp12-ისთვის, ჩვენ შევეცადეთ დაგვეხასიათებინა NMP-nsp9 დანამატის მასობრივი სპექტრომეტრიით (MS).რეკომბინანტული HCoV-229E nsp9 პროტეინის სრული მასის სპექტრი აჩვენებდა პიკს 12,045 Da (სურათი 4A).nsp12-ის დამატებამ არ შეცვალა nsp9-ის ხარისხი, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ nsp12 და nsp9 არ წარმოქმნიან სტაბილურ კომპლექსს გამოყენებულ პირობებში (დენატურაცია) (სურათი 4A).UTP და GTP-ის თანდასწრებით, nsp9 და nsp12 შემცველი რეაქციის მასის გაზომვამ აჩვენა, რომ UTP-ის ცილის მასა გადავიდა 306 Da, ხოლო GTP-ის ცილის მასა 345 Da, რაც მიუთითებს, რომ თითოეული nsp9 მოლეკულა აკავშირებს UMP ან GMP (სურათი 4) C და D).ვარაუდობენ, რომ NiRAN-ის შუამავლობით nsp9 NMPylation-ისთვის საჭირო ენერგია მოდის NTP ჰიდროლიზისა და პიროფოსფატის გამოთავისუფლებისგან.მიუხედავად იმისა, რომ ამ რეაქციაში გამოყენებული იყო nsp9 (სამიზნე) 10-ჯერ მეტი მოლარული ჭარბი ვიდრე nsp12 (ფერმენტი), დაფიქსირდა nsp9-ის თითქმის სრული NMPylation, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ nsp12-სა და nsp9-ს შორის ურთიერთქმედება ხანმოკლეა და nsp12-ს შეუძლია NMPylate მეტი nsp9. ინ ვიტრო მოლეკულა.

nsp9-ის ერთჯერადი NMPylation nsp12 და UTP ან GTP-ის თანდასწრებით.ნაჩვენებია HCoV-229E nsp9 (SI დანართი, ცხრილი S1) (AD) დაზიანებული სრული ცილის მასის სპექტრი.(A) მარტო nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP-ის თანდასწრებით, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP-ის თანდასწრებით.

nsp9 ნარჩენების დასადგენად UMPylated nsp12-ით, nsp9-UMP დაიშალა ტრიპსინთან ერთად.მიღებული პეპტიდები გამოეყო ნანო-მაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფიით (HPLC) და გაანალიზდა ტანდემური მასის სპექტრომეტრიით (MS/MS) ონლაინ.მონაცემთა ანალიზმა Byonic პროგრამული პაკეტის გამოყენებით (Protein Metrics) აჩვენა N-ტერმინალური ამინომჟავის UMPylation.ეს დადასტურებულია ხელით.წინამორბედი პეპტიდის [UMP]NNEIMPGK (SI დანართი, სურათი S5A) მასობრივი სპექტრის ტანდემმა გამოავლინა ფრაგმენტი 421 მ/წ სიჩქარით, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ UMP აკავშირებს nsp9-ის ნარჩენს 1.

nsp9-ის N-ბოლოზე, Asn კონსერვირებულია Orthocoronavirinae-ს წევრებს შორის (SI დანართი, სურათი S6).მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ გვჯერა, რომ N-ტერმინალური პირველადი ამინის აზოტი არის ყველაზე სავარაუდო მიმღები UMP-ისთვის, ჩვენ გადავწყვიტეთ მოგვეპოვებინა NMP-ის შეკავშირების დამატებითი მტკიცებულება N-ტერმინალზე.ამ მიზეზით, არაNMPylated და NMPylated N-ტერმინალური პეპტიდი nsp9 გაწმენდილი HPLC-ით მიღებული იყო აცეტონის და ნატრიუმის ციანობოროჰიდრიდის თანდასწრებით.ამ პირობებში, მხოლოდ თავისუფალი პირველადი ამინები შეიძლება შეიცვალოს პროპილით (25).N-ტერმინალური nsp9-დან მიღებული პეპტიდი NNEIMPGK თანმიმდევრობით შეიცავს ორ პირველად ამინებს, ერთი Asn-ის N-ბოლოზე და მეორე Lys-ის გვერდით ჯაჭვზე C-ბოლოზე.ამიტომ, პროპილის ჯგუფები შეიძლება დაინერგოს ორივე ბოლოში.არა-NMPylated პეპტიდების ამოღებული იონური ქრომატოგრამები ნაჩვენებია SI დანართში, სურათი S5B.როგორც მოსალოდნელი იყო, N-ტერმინალური და C-ტერმინალური (მონო)პროპილირებული (SI დანართი, სურათი S5B, ზედა ხაზი) ​​და დიპროპილირებული პეპტიდები (SI დანართი, სურათი S5B, ქვედა ხაზი) ​​შეიძლება გამოვლინდეს.ეს ნიმუში იცვლება nsp9-ის NMPylated N-ტერმინალური პეპტიდის გამოყენებით.ამ შემთხვევაში, შესაძლებელია მხოლოდ C-ტერმინალური პროპილირებული პეპტიდების იდენტიფიცირება, მაგრამ N-ტერმინალური პროპილირებული პეპტიდები და დიპროპილირებული პეპტიდები არ არის იდენტიფიცირებული (SI დანართი, სურათი S5C), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ UMP გადავიდა N-ტერმინალურ პირველად ამინში ამის თავიდან ასაცილებლად. ჯგუფი ცვლილებების შეტანისგან.

შემდეგი, ჩვენ ვცვლით (Ala ან Ser-ით) ან ვშლით შენახულ ნარჩენებს nsp9-ის N-ბოლოზე, რათა განვსაზღვროთ სამიზნე სპეციფიკური შეზღუდვები.ჩვენი MS მონაცემების საფუძველზე, რომელიც აჩვენებს, რომ NiRAN აყალიბებს nsp9-NMP დანამატს nsp9-ის N-ტერმინალური ნარჩენის პირველადი ამინით, ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ nsp9 NMPylation მოითხოვს ვირუსის მთავარ პროტეაზას (Mpro, nsp5) nsp9 N-ტერმინალის გასათავისუფლებლად. მისი პოლიპროტეინის წინამორბედი.ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად, ჩვენ შევქმენით წინამორბედი ცილა nsp7-11, რომელიც შეიცავს nsp9-ს E. coli-ში და ჩავატარეთ სტანდარტული NMPylation ტესტი [α-32P] UTP-ის (მასალები და მეთოდები) თანდასწრებით.როგორც ნაჩვენებია სურათზე 5A (ჩიხი 3), მოუჭრელი nsp7-11 წინამორბედი არ არის რადიოეტიკეტირებული nsp12-ით.ამის საპირისპიროდ, თუ nsp7-11 იშლება რეკომბინანტული nsp5-ით, რათა გამოთავისუფლდეს nsp9 (და სხვა nsps) წინამორბედისგან, აღმოჩენილია რადიო მარკირებული ცილა, რომელიც მიგრირებს nsp9-თან ერთად, რაც ადასტურებს ჩვენს დასკვნას, რომ NiRAN და N- კოვალენტური nsp9-NMP ადიდუქტების შერჩევითი წარმოქმნა. .N-ტერმინალური Asn-ის ტერმინალური პირველადი ამინი (პოზიცია 3825 pp1a/pp1ab-ში).ამ დასკვნას ასევე მხარს უჭერს ექსპერიმენტები nsp9 კონსტრუქციის გამოყენებით, რომელიც შეიცავს ერთ ან ორ დამატებით ნარჩენს N-ბოლოზე.ორივე შემთხვევაში, NiRAN-ის შუამავლობით nsp9-ის UMPylation გაუქმდა (SI დანართი, სურათი S7).შემდეგი, ჩვენ გამოვიმუშავეთ ცილა ერთი ან ორი Asn ნარჩენებით, წაშლილი 3825-NNEIMPK-3832 პეპტიდური თანმიმდევრობიდან nsp9-ის N-ტერმინალზე.ორივე შემთხვევაში, nsp9 UMPylation იყო მთლიანად დაბლოკილი (სურათი 5B), რაც დამატებით მტკიცებულებას იძლევა იმისა, რომ რეალური nsp9 N-ბოლო მოქმედებს როგორც NMP რეცეპტორი.

nsp9-ის პროტეოლიზური დამუშავება და N-ტერმინალური ნარჩენების როლი nsp12 შუამავლობით UMPylation-ში.(A) nsp9 UMPylation მოითხოვს უფასო nsp9 N-ტერმინალს.Nsp7-11-His6 წინასწარ ინკუბირებულია 30 °C-ზე NMPylation აღმოჩენის ბუფერში, რომელიც შეიცავს UTP-ს რეკომბინანტული Mpro-ს (nsp5-His6) თანდასწრებით ან არარსებობით.3 საათის შემდეგ, დაიწყეთ NMPylation ანალიზი nsp12-His6-ის დამატებით, როგორც აღწერილია მასალები და მეთოდები.nsp5-His6 (ხაზი 1) და nsp9-His6 (ხაზი 2) შემცველი რეაქცია გამოყენებული იყო როგორც კონტროლი.10 წუთის შემდეგ რეაქცია შეწყდა და სარეაქციო ნარევი გამოეყო SDS-PAGE-ით.ცილა შეღებილი იყო Coomassie Brilliant Blue-ით (A, ზედა).Nsp7-11-His6 წინამორბედი და დამუშავებული პროდუქტი nsp5-His6 შუამავლობით გაყოფის შედეგად ნაჩვენებია მარჯვნივ.გთხოვთ გაითვალისწინოთ (მათი მცირე ზომის გამო), რომ nsp7 და nsp11-His6 არ არის გამოვლენილი ამ გელში და რეაქციას ავსებს nsp5-His6 (ხაზები 1 და 4; nsp5-His6-ის პოზიცია მითითებულია მყარი წრით) ან nsp9-His6 (ჩიხი 2) შეიცავს მცირე რაოდენობით MBP-ს (მითითებულია ღია წრეებით) ნარჩენ მინარევებს, რადგან ისინი გამოხატულია როგორც MBP შერწყმა პროტეინები (SI დანართი, ცხრილი S1).(B) Nsp9-His6 ვარიანტს აკლია ერთი ან ორი N-ტერმინალური Asn ნარჩენი (ნარჩენების ნუმერაცია pp1a/pp1ab-ში პოზიციის მიხედვით) და გაწმენდილია და ინკუბირებულია nsp12-His6 და [α-32P] UTP-ით.B, SDS-PAGE შეღებილი Coomassie-ით ნაჩვენებია ზევით, B, შესაბამისი ავტორადიოგრაფი ნაჩვენებია ქვემოთ.მოლეკულური წონის მარკერის პოზიცია (კილოდალტონებში) ნაჩვენებია მარცხნივ.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ტერმინალის შენახული ნარჩენები შეიცვალა Ala ან Ser-ით და იგივე რაოდენობის ცილა გამოყენებული იყო nsp12-His6 შუამავლობით UMPylation რეაქციაში.რეაქციის პროდუქტები გამოყოფილი იყო SDS-PAGE-ით და შეღებილი იქნა Coomassie Brilliant Blue-ით (C, ზემოდან), და რადიო მარკირებული nsp9-His6 გამოვლინდა ფოსფორესცენციური გამოსახულების საშუალებით (C, შუა).ველური ტიპის (wt) პროტეინის გამოყენებით (დაყენებული 100%), ფარდობითი NMPylation აქტივობა (საშუალო ± SEM) გამოთვლილი იყო სამი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან.(D) ვირუსის ტიტრები p1 უჯრედის კულტურის ზენატანტში Huh-7 უჯრედების ინფიცირებული HCoV-229E ველური ტიპის Huh-7 უჯრედებით და მუტანტები, რომლებიც ატარებენ დანიშნულ ამინომჟავის შემცვლელებს nsp9-ში, განისაზღვრა დაფის ანალიზით.რეპლიკაციის დეფიციტი RdRp მოტივი C ორმაგი მუტანტი DD4823/4AA გამოყენებული იყო, როგორც უარყოფითი კონტროლი.

nsp9-ის N-ბოლო (განსაკუთრებით 1, 2, 3 და 6 პოზიციები) ძალზედ დაცულია Orthocoronavirinae ქვეოჯახის წევრებს შორის (SI დანართი, სურათი S6).ამ ნარჩენების შესაძლო როლის შესასწავლად nsp12 შუამავლობით nsp9 NMPylation-ში, ორი თანმიმდევრული Asn ნარჩენი nsp9-ის N-ბოლოზე შეიცვალა Ala ან Ser-ით (ცალკე ან კომბინაციით).ველური ტიპის nsp9-თან შედარებით, N3825-ით Ala-ით ან Ser-ით ჩანაცვლებამ გამოიწვია nsp12 შუამავლობით UMPylation-ის ორჯერ მეტი შემცირება (სურათი 5C).ჩვენი დასკვნის შესაბამისად, რომ NMPylation ხდება N-ტერმინალურ პირველად ამინში, ნაცვლად N-ტერმინალური ნარჩენის გვერდითი ჯაჭვისა, ჩვენ დავინახეთ მნიშვნელოვანი ნარჩენი NMPylation N3825A და N3825S-ის ჩანაცვლებით.საინტერესოა, რომ თუ მეორე Asn შეიცვალა Ala ან Ser-ით, nsp9 UMPylation მცირდება უფრო ძლიერად (10-ჯერ მეტი), ხოლო Ala-ს ჩანაცვლება 3, 4 და 6 პოზიციებზე მხოლოდ ზომიერ გავლენას ახდენს nsp9 UMPylation-ზე (სურათი 2). ) .5C).მსგავსი შედეგები იქნა მიღებული ATP, CTP ან GTP გამოყენებით (SI დანართი, სურათი S8).ერთობლივად, ეს მონაცემები მიუთითებს N2826-ის საკვანძო როლზე (პოზიცია 2 nsp9-ში) nsp9 NMPylation-ში.

იმისათვის, რომ მივიღოთ დამატებითი მტკიცებულება nsp9-სა და NMPylation-ის N-ბოლოებს შორის ფუნქციური კორელაციის შესახებ, ჩვენ შევასრულეთ კორონავირუსების ოჯახის nsp9 თანმიმდევრობის მრავალჯერადი თანმიმდევრობის გასწორება (MSA) (იცვლება 104 და 113 ნარჩენებს შორის) (SI დანართი, სურათი. S6).მთლიანობაში, Orthocoronavirinae ქვეოჯახის 5 გვარის 47 (ცნობილ და სავარაუდო) სახეობაში, რომლებიც აინფიცირებენ სხვადასხვა ძუძუმწოვრებს, ფრინველებს და ქვეწარმავლებს, სულ მხოლოდ 8 ნარჩენი აღმოჩნდა უცვლელი.ყველაზე ფართო ცვლილებები, მათ შორის წაშლა და ჩასმა, დაფიქსირდა ციკლებში nsp9-ის მეორადი სტრუქტურის ელემენტებს შორის, როგორც ეს იყო განსაზღვრული წინა სტრუქტურული კვლევებით (26 ??28).nsp9-ის C-ტერმინალური ნაწილის β ძაფსა და α სპირალში აღმოაჩინეს ხუთი უცვლელი ნარჩენი.სამი უცვლელი ნარჩენი წარმოადგენს nsp9-ის N ტერმინალის NNE მოტივს.გამოვლინდა, რომ ამ მოტივის მეორე ასნი ერთადერთი უცვლელი ნარჩენია, რომელსაც ასევე იზიარებს შორეულ მონათესავე ბაყაყის კორონავირუსის ჰიპოთეტური nsp9 და წარმოადგენს Microhyla letovirus 1 სახეობას Alphaletovirus-ის Letovirinae ქვეოჯახში.nsp9 მეორადი სტრუქტურის ელემენტებში ნარჩენების კონსერვაცია შეიძლება რაციონალური იყოს სტრუქტურული მოსაზრებებით დასაკეცი ან ცნობილი რნმ-ის დამაკავშირებელი თვისებების შესანარჩუნებლად.თუმცა, როგორც ჩანს, ეს მსჯელობა არ ეხება NNE-ს კონსერვაციას და ამ კვლევამდე, შეზღუდვების ბუნება, რომელიც ზღუდავს ტრიპეპტიდური თანმიმდევრობის ცვალებადობას, სრულიად ბუნდოვანი იყო.

იმისათვის, რომ განვსაზღვროთ nsp9-NMPylation და NNE კონსერვაციის მნიშვნელობა კოროვირუსის რეპლიკაციაში, ჩვენ შევქმენით HCoV-229E მუტანტები, რომლებიც ატარებენ nsp9 N-ტერმინალის ნარჩენების ერთ ან ორმაგ ჩანაცვლებას, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ nsp9 NMPylation საზიანოა in vitro.სანამ დავიწყებთ, ჩვენ ვცდილობთ ვუპასუხოთ კითხვას, გავლენას ახდენს თუ არა ეს ჩანაცვლებები (nsp8|9 დაშლის ადგილთან ახლოს) C-ტერმინალური pp1a რეგიონის პროტეოლიზურ დამუშავებაზე.nsp7-11 პოლიპროტეინის კონსტრუქციების ნაკრები, რომელიც შეიცავდა შესაბამის ჩანაცვლებებს nsp9-ის N-ბოლოზე წარმოებული იყო E. coli-ში და მოჭრილი იქნა რეკომბინანტული Mpro-ით.ოთხი ადგილის პროტეოლიზურ გაყოფაზე (nsp9 ფლანგური უბნის ჩათვლით) მნიშვნელოვან გავლენას არ ახდენს რაიმე შემოღებული ჩანაცვლება (SI დანართი, სურათი S9), ამ ცილებში სტრუქტურული ცვლილებების გამოკლებით, რომლებიც ხელს უშლის Mpro-შუამავლობით nsp8|9 გაყოფას (ან სხვა) ვებგვერდი.

Huh-7 უჯრედები გადაიცვეს გენომის სიგრძის HCoV-229E რნმ-ით, რომელიც აკოდირებს Ala ან Ser ჩანაცვლებებს კონსერვაციულ NNE ტრიპეპტიდებში (N3825, N3826 და E3827) nsp9 N ბოლოში, რაც აჩვენებს, რომ მუტაციების უმეტესობა ფატალურია.ჩვენ შევძელით ვირუსის გადარჩენა N-ტერმინალის Asn-ის Ser ან Ala-ს (N2835A ან N2835S) ჩანაცვლებით, მაგრამ ვერ მოვახერხეთ ვირუსის აღდგენა სხვა ერთჯერადი და ორმაგი მუტაციებით NNE თანმიმდევრობით (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (სურათი 5D).

ეს შედეგები მიუთითებს, რომ კოროვირუსების რეპლიკაცია ქსოვილის კულტურაში შეზღუდულია (იგივე ან მსგავსი), ზღუდავს ორგანიზმში nsp9 NMPylation ადგილების ბუნებრივ მუტაციას და მხარს უჭერს ამ პასუხის მთავარ როლს კოროვირუსების სასიცოცხლო ციკლში.

ექსპერიმენტების ბოლო კრებულში ჩვენ ვაწარმოეთ C-ტერმინალი His6 ეტიკეტირებული SARS-CoV-2 nsp12 და nsp9 და nsp12-ის ორი მუტანტური ფორმა E. coli-ში.აქტიური უბნის ნარჩენები NiRAN და RdRp დომენებში იყო, შესაბამისად, გამოიყენეთ Ala ნაცვლად (სურათი 6A და SI დანართი, ცხრილი S2).K4465 SARS-CoV-2 nsp12-ში შეესაბამება K4135-ს HCoV-229E-ში (SI დანართი, სურათი S2), რომელიც აღმოჩნდა საჭირო NiRAN-ის აქტივობისა და HCoV-229E რეპლიკაციისთვის (სურათი 3D და E).ეს ნარჩენი ასევე შეესაბამება არტერიული ვირუსის EAV nsp9 K94 ნარჩენს, რომელიც ადრე ნაჩვენები იყო, რომ აუცილებელია NiRAN თვით-UMPylation/self-GMPylation (16).როგორც ნაჩვენებია სურათზე 6B, SARS-CoV-2 nsp12-ს აქვს UMP ტრანსფერაზას აქტივობა nsp9-ის გამოყენებით, როგორც სუბსტრატს, ხოლო nsp12_K4465A აქტიური საიტის მუტანტი არააქტიურია.ორმაგი ჩანაცვლება SDD-ს დამახასიათებელ თანმიმდევრობაში RdRp მოტივი C არ ახდენს გავლენას UMP ტრანსფერაზას აქტივობაზე (სურათი 6B), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ RdRp აქტივობას არ აქვს პირდაპირი ეფექტი nsp9 UMPylation-ში.მსგავსი მონაცემები იქნა მიღებული CTP, GTP და ATP გამოყენებით (SI დანართი, სურათი S10).მოკლედ, ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ NiRAN შუამავლობით nsp9 NMPylation-ს აქვს კონსერვატიული აქტივობა კოროვირუსებში, რომლებიც წარმოადგენენ ორთოკორონავირუსების ქვეოჯახის სხვადასხვა გვარს.

SARS-CoV-2 nsp12 შუამავლობით nsp9-ის NMPylation.(A) Coomassie შეღებილი SDS-პოლიაკრილამიდური გელი, რომელიც აჩვენებს რეკომბინანტულ ცილას, რომელიც გამოიყენება NMPylation ტესტში.როგორც კონტროლი, გამოყენებული იქნა მუტანტის ცილა აქტიური ადგილის ჩანაცვლებით SARS-CoV-2 nsp12-ის NiRAN დომენში (K4465A) და RdRp დომენში (DD5152/3AA).ნარჩენების ნუმერაცია ეფუძნება პოზიციას pp1ab-ში.(B) UMPylation-ის გამოვლენის ავტორადიოგრაფი nsp9-His6 და [α-32P]UTP, როგორც nsp12-His6-ის სუბსტრატი (ველური ტიპის [wt] და მუტანტის) გამოყენებით.მონიშნული ცილის მოლეკულური მასა (კილოდალტონებში) ნაჩვენებია მარცხნივ.

NiRAN დომენები ზოგადად კონსერვირებულია Nidovirales-ში (16), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ისინი კატალიზირებენ ფერმენტულ რეაქციებს, რომლებიც აუცილებელია ნიდოვირუსის რეპლიკაციისთვის.ამ კვლევაში ჩვენ შევძელით დაგვემტკიცებინა, რომ კორონავირუსის NiRAN დომენი გადასცემს NMP-ს (გენერირდება NTP-დან) nsp9-ზე, იდუმალი რნმ-ის დამაკავშირებელ ცილაზე, რომელიც მონაწილეობს ვირუსის რეპლიკაციაში (26 ?? 29), რათა განვსაზღვროთ ის, როგორც ბუნებრივი სამიზნე და კორონავირუსის RTC-ის პარტნიორი.

NiRAN დომენი იზიარებს სამი მიმდევრობის მოტივს (AN, BN და CN), რომლებიც შეიცავს ნარჩენების ძალიან მცირე რაოდენობას, რომლებიც კონსერვირებულია ყველა ოჯახში მონოფილური, მაგრამ უაღრესად დიფერენცირებული Nidovirales რიგით (8, 16).ბოლოდროინდელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ ისინი სტრუქტურულად დაკავშირებულია პროტეინ კინაზას მსგავსი ცილების დიდწილად დაუხასიათებელ ოჯახთან, რომელსაც თავდაპირველად SelO ოჯახს ეძახდნენ (17, 19, 22, 30, 31).SelO-სთან დაკავშირებულ პროტეინებს აქვთ კინაზას ნაკეცები, მაგრამ არ გააჩნიათ რამდენიმე კონსერვირებული აქტიური ადგილის ნარჩენები კლასიკურ კინაზებში (22, 32).ATP მოლეკულების საპირისპირო ორიენტაციის საფუძველზე, რომლებიც დაკავშირებულია აქტიურ ადგილზე და სტაბილიზირებულია სპეციფიკური ურთიერთქმედებით, SelO იყო ჰიპოთეზა და შემდგომში დადასტურდა AMP (ფოსფატის ნაცვლად) გადატანა ცილოვან სუბსტრატზე (22), ხოლო სხვა ბაქტერიული SelO-ს მსგავსი პროტეინი YdiU აქვს. ახლახან აჩვენა, რომ კატალიზატორია UMP-ის კოვალენტური მიმაგრება Tyr-თან და სხვადასხვა ცილის სუბსტრატების მის ნარჩენებთან (33).

კორონავირუსის NiRAN დომენის სავარაუდო აქტიური უბნის ნარჩენების პროგნოზის დასადასტურებლად და გაფართოების მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ ბიოქიმიური და საპირისპირო გენეტიკური მეთოდები კოროვირუსის nsp12-ზე მუტაციის ანალიზის შესასრულებლად (სურათი 3D და E და SI დანართი, სურათი S3 და ცხრილი) S1â S4).მონაცემები აჩვენებს, რომ HCoV-229E K4135, R4178 და D4280 Ala-ით ჩანაცვლება გამორიცხავს in vitro NMP ტრანსფერაზას აქტივობას და ვირუსის რეპლიკაციას უჯრედულ კულტურაში (სურათი 3D და E და SI დანართები, სურათი S3), რაც მხარს უჭერს მათ არსებობას NTP γ-ფოსფატში. (K4135, R4178) და აქტიური საიტის ლითონის იონების კოორდინაცია (D4280).E4145A კონსერვირებული Glu-ს ჩანაცვლება ფრინველის ბუდის ვირუსის დიაპაზონში, რომელიც პროგნოზირებდა K4135 (17) პოზიციის სტაბილიზაციას, ნაჩვენები იყო ვირუსის რეპლიკაციის აღმოსაფხვრელად, მაგრამ გასაკვირი იყო, რომ აქტივობა შენარჩუნდა in vitro NMPylation ანალიზში (სურათი 3D და E და SI დანართი, სურათი S3 და ცხრილები S1–S4).მსგავსი დაკვირვება განხორციელდა, როდესაც შესაბამისი ჩანაცვლება შემოიღეს Salmonella typhimurium-ის YdiU ჰომოლოგში (E130A) (33).ერთად აღებული, ეს მონაცემები მხარს უჭერს ამ შენახული ნარჩენის მარეგულირებელ ფუნქციას და არა კატალიზურ ფუნქციას.

კონსერვირებული Phe ნარჩენის (F4281A) ჩანაცვლებამ ნესტოვირუსის დიაპაზონში HCoV-229E NiRAN დომენში (8) გამოიწვია NMPylation აქტივობის შემცირება in vitro და ვირუსის რეპლიკაციის მნიშვნელოვანი შემცირება უჯრედულ კულტურაში (სურათი 3D, E და SI). დანართი, სურათი S3).მონაცემები შეესაბამება ამ ნარჩენის მნიშვნელოვან მარეგულირებელ ფუნქციას, როგორიცაა ადრე ნაჩვენები ჰომოლოგიური DFG მოტივი Phe ნარჩენი.კლასიკურ პროტეინ კინაზებში, ის არის Mg2+ შემაკავშირებელი მარყუჟის ნაწილი და ხელს უწყობს ხერხემლის შეკრებას და რეგულირებას???საჭიროა ეფექტური კატალიზური აქტივობისთვის (32, 34).Ala-ს და Arg-ის K4116 ნარჩენების ჩანაცვლება (preAN მოტივში), შესაბამისად, აღმოფხვრა ვირუსის რეპლიკაცია და, როგორც მოსალოდნელი იყო, ჰქონდა განსხვავებული ეფექტები NMP ტრანსფერაზას აქტივობაზე in vitro, რაც დამოკიდებულია შემოღებულ ამინომჟავის გვერდით ჯაჭვზე (სურათი 3D And E და SI დანართები). , სურათი S3).ფუნქციური მონაცემები შეესაბამება სტრუქტურულ ინფორმაციას, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ამ ნარჩენმა დაამყარა ურთიერთქმედება ATP ფოსფატთან (17).სხვა ჩადგმული ვირუსების ოჯახების NiRAN დომენში, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 იკავებს Lys, Arg ან His (8), რაც მიუთითებს, რომ ამ კონკრეტული ნარჩენის ფუნქციური შეზღუდვა შემსუბუქებულია.D4188A და D4283A ჩანაცვლება გამორიცხავს ან ძლიერ ამცირებს ფერმენტის აქტივობას და გამორიცხავს ვირუსის რეპლიკაციას (სურათი 3).ეს ორი ნარჩენი შენარჩუნებულია უმეტეს (მაგრამ არა ყველა) ბუდებულ ვირუსებში (8), რაც მიუთითებს მნიშვნელოვან ოჯახზე სპეციფიკურ, მაგრამ შესაძლოა არა კატალიზურ ფუნქციაზე.რამდენიმე სხვა Lys და Asp ნარჩენების Ala ჩანაცვლება (K4113A, D4180A, D4197A და D4273A), რომლებიც არ არის კონსერვირებული Coronaviridae-ში ან Nestioviridae-ის სხვა ოჯახებში (8) გამოყენებული იყო საკონტროლოდ.როგორც მოსალოდნელი იყო, ეს ჩანაცვლებები დიდწილად ტოლერანტულია, ფერმენტის აქტივობის უმნიშვნელო შემცირებით და ზოგიერთ შემთხვევაში ვირუსის რეპლიკაციით (სურათი 3 და SI დანართი, სურათი S3).მთლიანობაში, კორონავირუსის მუტაგენეზის მონაცემები ძალიან შეესაბამება EAV NiRAN-RdRp (16) თვით-GMP და შებრუნებული გენეტიკის მონაცემებს, რომელშიც EAV nsp9 (კორონავირუსის nsp12 ორთოლოგი) ნარჩენი K94 (შეესაბამება HCoV- 229E K4135) მნიშვნელოვან ფუნქციებს ასრულებს. R124 (შეესაბამება R4178), D132 (შეესაბამება D4188), D165 (შეესაბამება D4280), F166 (შეესაბამება F4281).გარდა ამისა, HCoV-229E მუტაგენეზის მონაცემები შეესაბამება და გაფართოვებულია ადრე მოხსენებული SARS-CoV-ის საპირისპირო გენეტიკური მონაცემებიდან (16), ისევე, როგორც ძალიან მსგავსი, რაც დაფიქსირდა შესაბამისი CN მოტივისთვის Phe-to-Ala მუტანტის SARS-CoV_nsp12. აღწერილი ფენოტიპი -F219A და HCoV-229E_F4281A (სურათი 3 D და E და SI დანართი, სურათი S3 და ცხრილი S1-S4).

EAV ორთოლოგებთან შედარებით (16), რომლებსაც აქვთ აშკარა უპირატესობა UTP და GTP (თვით-NMPylation რეაქციაში), ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ კორონავირუსის NiRAN დომენი (წარმოდგენილი HCoV-229E და SARS-CoV-2) შეიძლება ეფექტური იყოს. გადაეცა ოთხივე NMP-ს, თუმცა არის მცირე უპირატესობა UMP-ზე (სურათები 1 და 3).სპეციფიკური NTP კო-სუბსტრატის შედარებით დაბალი სპეციფიკა შეესაბამება ახლახან მოხსენებულ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 სუპერკომპოზიტურ სტრუქტურას, რომელშიც ADP-Mg2+ უკავშირდება NiRAN-ის აქტიურ ადგილს, მაგრამ არა ადენინის ნაწილს. კონკრეტული ურთიერთქმედების ფორმირებისა (17).ჩვენს კვლევაში, NMPylation რეაქციაში გამოყენებული ნუკლეოტიდის ტიპს არ აქვს დიფერენციალური ეფექტი მუტანტის ცილის აქტივობაზე (SI დანართი, სურათი S3), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ არცერთი ეს ნარჩენი არ არის მჭიდროდ დაკავშირებული სპეციფიკური ნუკლეობაზის შეკავშირებასთან.სტრუქტურული საფუძველი და პოტენციური ბიოლოგიური მნიშვნელობა NTP კო-სუბსტრატის სხვადასხვა პრეფერენციებისა, რომლებიც შეინიშნება კოროვირუსების და არტერიული ვირუსების NiRAN დომენებში, ჯერ კიდევ შესასწავლია;ისინი შეიძლება იყოს ჭეშმარიტი ან შეიძლება გამოწვეული იყოს მათი შესაბამისი კვლევების შეზღუდვით.ამჟამად, არ არის გამორიცხული, რომ არტერიული ვირუსის NiRAN დომენის პოტენციურ NMPylator აქტივობას (ადრე დახასიათებულ თვით-NMPylation აქტივობასთან შედარებით) აქვს განსხვავებული თანა-სუბსტრატის უპირატესობა, იმის გათვალისწინებით, რომ მსგავსება არტერიულსა და კოროვირუსს შორის. NiRAN დომენი მის ლიმიტზეა.თანმიმდევრობით დაფუძნებული შედარება (16).ფსევდოკინაზა SelO-სთან შედარებით, რომელიც იყენებს Mg2+-ს კოფაქტორად, კორონავირუსისა და არტერიული ვირუსის NiRAN აქტივობა დამოკიდებულია Mn2+-ზე (16) (სურათი 3C და SI დანართი, სურათი S1).Mn2+ დამოკიდებულება და აშკარა უპირატესობა UTP-ზე არის ცილოვანი NMPylators-ის უჩვეულო მახასიათებელი და სულ ახლახან დადასტურდა Salmonella typhimurium-ის YdiU ცილაში, რომელიც კატალიზებს მკაცრ Mn2+-ზე დამოკიდებულ ცილოვან შაპერონულ UMPylation-ს, რათა დაიცვას უჯრედები სტრესის ინდუქციური უჯრედების ATP აუზისგან. 33).

ახლახან აღწერილი სტრუქტურული მსგავსება კორონავირუსის NiRAN დომენსა და უჯრედულ პროტეინ კინაზებს შორის (17, 19) დამატებით მხარდაჭერას იძლევა NiRAN-ის უნარის კოვალენტურად დააკავშიროს NMP სხვა პროტეინებთან, რომლებიც ჩვენ მოხსენებული გვაქვს ამ კვლევაში.ჩვენ გავამახვილეთ ჩვენი ძიება შესაძლო NiRAN სამიზნეებზე HCoV-229E ORF1a-ს მიერ დაშიფრულ პროტეინებზე, რომლებიც, როგორც ცნობილია, პირდაპირ ან ირიბად ეხმარება RTC-ის ORF1b-ში დაშიფრულ რეპლიკაზას (12, 35).ჩვენი ექსპერიმენტები იძლევა დამაჯერებელ მტკიცებულებებს nsp9-ის ეფექტური და სპეციფიკური NMPylation-ის შესახებ (სურათი 2).თუ სამიზნე ცილა გამოიყენება მოლარულ სიჭარბეში, რომელიც 8-დან 10-ჯერ აღემატება ფერმენტის ცილას (nsp12), დადასტურებულია, რომ nsp9 მთლიანად (მონო)NMPized (სურათი 4).ჩვენ დავასკვენით, რომ nsp12-სა და nsp9-ს შორის ურთიერთქმედება ხანმოკლეა და არ შექმნის სტაბილურ კომპლექსს nsp9-თან (სხვა RTC ქვედანაყოფების არარსებობის შემთხვევაში).ამ დასკვნას მხარს უჭერს პროტეინის ურთიერთქმედების კვლევები SARS-CoV პროტეომზე (35).MS ანალიზმა დაადგინა nsp9-ის N-ტერმინალური ნარჩენის პირველადი ამინი, როგორც NMPylation ადგილი (SI დანართი, სურათი S5).ფოსფორამიდატის ბმისა და N-ტერმინალური ამინო ჯგუფის წარმოქმნა განასხვავებს NiRAN-ის შუამავლობით NMPylation აქტივობას Pseudomonas syringae SelO-შუამავლობითი ამპილირების რეაქციისგან, რომელიც კატალიზებს O-დაკავშირებულ AMP-ის წარმოქმნას Ser, Thr ან Tyr ნარჩენების პეპტიდის ადიდუქტში. 22), და S. typhimurium YdiU აყალიბებს O-დაკავშირებულ (Tyr-თან) და N-დაკავშირებულ (His-თან) პეპტიდ-UMP დანამატებს.შეზღუდული ინფორმაცია ხელმისაწვდომია SelO ცილების ოჯახის შესახებ მიუთითებს, რომ ამ დიდი ცილის ოჯახის წევრები ძლიერ განსხვავდებიან პეპტიდ-NMP დანამატების წარმოქმნით.ეს არის საინტერესო დაკვირვება, რომელიც შემდგომ შესწავლას იმსახურებს.

ამ კვლევაში მიღებულმა მონაცემებმა მიგვიყვანა ჰიპოთეზაზე, რომ nsp9-ის NMPylation საჭიროებს თავისუფალ N-ტერმინას.ვირუსული რეპლიკაციის კონტექსტში, ეს უზრუნველყოფილი იქნება nsp8|nsp9 დამუშავების ადგილის პროტეოლიზური გაყოფით რეპლიკაზას პოლიპროტეინში pp1a შუამავლობით Mpro და pp1ab.კოროვირუსების უმეტესობაში, განსხვავება ამ კონკრეტულ ადგილს (VKLQ|NNEI HCoV-229E-ში) და ყველა სხვა კორონავირუსის Mpro დაშლის ადგილს შორის არის Asn (და არა სხვა მცირე ნარჩენები, როგორიცაა Ala, Ser ან Gly) იკავებს P1â???მდებარეობა (36).ადრეულ კვლევებში მიღებულმა პეპტიდის დაშლის მონაცემებმა აჩვენა, რომ nsp8|nsp9 ადგილის დაშლის ეფექტურობა სხვა უბნებთან შედარებით დაბალი იყო, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ 1) ამ კონკრეტულ ადგილს შეიძლება ჰქონდეს მარეგულირებელი როლი C-ტერმინალის დროულ კოორდინირებულ დამუშავებაში. pp1a რეგიონი, ან 2) a სპეციალური კონსერვირებული nsp9 N-ტერმინალის როლი ვირუსის რეპლიკაციაში (37).ჩვენმა მონაცემებმა (სურათი 5A) აჩვენა, რომ nsp9-ის რეკომბინანტული ფორმა, რომელიც ატარებს რეალურ N-ტერმინალურ თანმიმდევრობას, ეფექტურად იყო NMPized nsp12-ით.N-ტერმინალური ფლანგური თანმიმდევრობა ამოღებულ იქნა Xa ფაქტორით (nsp9-His6; SI დანართი, ცხრილი S1) ან Mpro-შუამავლობითი გაყოფა (nsp7-11-His6; სურათი 5A და SI დანართი, ცხრილი S1).მნიშვნელოვანია, რომ მოუჭრელი nsp9-ის შემცველი წინამორბედი nsp7-11-His6 აჩვენებდა წინააღმდეგობას nsp12-ის NMPylation-ის მიმართ, რაც შეესაბამება ჩვენს მონაცემებს, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ nsp9-NMP დანამატი წარმოიქმნება N-ტერმინალური პირველადი ამინის მეშვეობით (SI დანართი, სურათი S5) .NiRAN სუბსტრატის სპეციფიკის უფრო ღრმა გაგებისთვის, ჩვენ შემდეგ ყურადღება გავამახვილეთ nsp9-ის მიმდებარე N-ტერმინალის ნარჩენებზე.სხვა ცილების არარსებობის შემთხვევაში, ისინი სტრუქტურულად მოქნილები არიან, რაც ხელს უშლის მათ გამოვლენას nsp9-ის დაუწერელ ფორმაში (26 28, 38), რაც მიუთითებს მათ შეზღუდულ ბუნებრივ ცვალებადობაზე. nsp9 N-ტერმინალური ფრაგმენტის ფუნქცია.ამ რეგიონში შენახული ნარჩენების Ala ჩანაცვლება (სურათები 5C და D და SI დანართი, სურათი S8) ცხადყოფს, რომ N3826 აუცილებელია nsp9 NMPylation in vitro, ხოლო N3825A და E3827A ჩანაცვლება იწვევს NMPylation-ის შემცირებას, ხოლო M3829A და P38 ჩანაცვლება არა. .აშკარად იმოქმედებს nsp9 NMPylation-ზე.მიუხედავად იმისა, რომ N-ტერმინალური Asn-ის (N3825A, N3825S) ჩანაცვლება მხოლოდ ზომიერ გავლენას ახდენს nsp9 NMPylation და ვირუსის რეპლიკაციაზე უჯრედულ კულტურაში (სურათი 5C და D), Asn ნარჩენების თანმიმდევრობის წაშლა N-ტერმინალური 3825-NN დიპეპტიდიდან. დადასტურდა, რომ ის სასიკვდილოა ვირუსებისთვის, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ საჭიროა ერთი Asn ნარჩენი მეორე ნარჩენამდე N-ბოლოზე, სასურველია Asn, თუმცა, როგორც ჩანს, მსგავსი ნარჩენების ჩანაცვლება ნაწილობრივ შეიძლება მოითმინოს (სურათი 5B, C და D).ჩვენ ვასკვნით, რომ 3825-NN დიპეპტიდი, განსაკუთრებით კონსერვირებული და არსებითი N3826 ნარჩენი კოროვირუსის დიაპაზონში (SI დანართი, სურათი S6), უზრუნველყოფს nsp9 N-ტერმინალის სწორ შეკავშირებას და ორიენტაციას NiRAN-ის აქტიურ ადგილზე.

Ala (E3827A) ჩანაცვლება ყველა ქვეოჯახის კონსერვირებული Glu-ით ინარჩუნებს nsp9 NMPylation in vitro, მაგრამ სასიკვდილოა ვირუსებისთვის უჯრედულ კულტურაში (სურათი 5C და D), რაც მიუთითებს ამ ნარჩენის დამატებით ფუნქციაზე, მაგალითად, საკვანძო ურთიერთქმედებებში (NMPylated ან unmodified ) nsp9 N-ბოლო და სხვა ფაქტორები, რომლებიც მონაწილეობენ ვირუსის რეპლიკაციაში.Nsp9 მუტაციები არ ახდენდა გავლენას nsp9-ის პროტეოლიზურ პროცესზე ან რომელიმე მიმდებარე nsps-ზე (39) (SI დანართი, სურათი S9), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ დაფიქსირებული რამდენიმე nsp9 მუტაციის ლეტალური ფენოტიპები არ იყო გამოწვეული C პროტეოლიზური პროცესის ტერმინალის pp1a არეალის დისრეგულირებით. .

ზემოაღნიშნული მონაცემები იძლევა მტკიცებულებას, რომ nsp8|9 გაყოფის ადგილის Mpro შუამავლობით დამუშავების შემდეგ pp1a/pp1ab, nsp9-ის N-ბოლო შეიძლება იყოს UMPylated (ან ნაწილობრივ მოდიფიცირებული სხვა NMP-ით).გარდა ამისა, nsp9-ის N-ტერმინალის შესანიშნავმა კონსერვაციამ (კორონავირუსის ოჯახში სინგულარული და ინვარიანტული Asn ნარჩენების ჩათვლით) და ამ კვლევაში მიღებულმა საპირისპირო გენეტიკური მონაცემებმა (სურათები 3E და 5D) მიგვიყვანა დასკვნამდე, რომ აღწერილი nsp9 NMPylation არის ბიოლოგიურად დაკავშირებული და აუცილებელია კორონავირუსის რეპლიკაციისთვის.ამ მოდიფიკაციის ფუნქციური შედეგები შესასწავლად რჩება, მაგალითად, ადრე აღწერილი (არასპეციფიკური) nsp9 (არამოდიფიცირებული ფორმა) რნმ-ის შემაკავშირებელ აქტივობასთან დაკავშირებით (2628).N-ტერმინალური NMPylation ასევე შეიძლება გავლენა იქონიოს nsp9-ის ურთიერთქმედებაზე ცილებთან ან რნმ სუბსტრატებთან ან სხვადასხვა ოთხდონიანი შეკრების ფორმირებაზე.ეს დაფიქსირდა სტრუქტურულ კვლევებში და დადასტურდა, რომ ფუნქციურად დაკავშირებულია კორონავირუსის რეპლიკაციასთან, თუმცა განსაკუთრებით ამ მოდიფიკაციის არარსებობის შემთხვევაში (26- â29, 40).

მიუხედავად იმისა, რომ კორონავირუსის NiRAN დომენის სამიზნე სპეციფიკა ჯერ კიდევ უფრო დეტალურად უნდა დახასიათდეს, ჩვენი მონაცემები აჩვენებს, რომ კოროვირუსის NiRAN დომენის ცილის სამიზნე სპეციფიკა ძალიან ვიწროა.მიუხედავად იმისა, რომ ძირითადი აქტიური უბნის ნარჩენების კონსერვაცია (8, 16) ყველა ნიდოვირუსის ოჯახის NiRAN დომენში მტკიცედ უჭერს მხარს ამ ცილების შენახული NMPylator-ის აქტივობას, ამ დომენის სუბსტრატის დამაკავშირებელი ჯიბის ნარჩენების იდენტურობა კონსერვაცია და კონსერვაცია რჩება დასახასიათებელი. და შეიძლება განსხვავდებოდეს Nidovirales-ის მიზნების სხვადასხვა ოჯახებს შორის.ანალოგიურად, სხვა ჩადგმული ვირუსების შესაბამისი სამიზნეები ჯერ კიდევ არ არის განსაზღვრული.ისინი შეიძლება იყოს nsp9-ის ან სხვა ცილების დისტანციური ორთოლოგები, რადგან ხუთი რეპლიკაზის დომენის გარეთ არსებული თანმიმდევრობები, რომლებიც ძირითადად კონსერვირებულია ბუდებულ ვირუსებში, ნაკლებად არის კონსერვირებული (8), მათ შორის გენომის მასივი Mpro-სა და NiRAN-ს შორის, მათ შორის, nsp9 მდებარეობს კორონავირუსი.

გარდა ამისა, ჩვენ არ შეგვიძლია გამოვრიცხოთ შესაძლებლობა, რომ NiRAN დომენს ჰქონდეს დამატებითი (მათ შორის ფიჭური) სამიზნეები.ამ შემთხვევაში, აღსანიშნავია, რომ ბაქტერიულ ჰომოლოგებს ამ წარმოქმნილი ცილის NMPylators (NMPylators) (30, 31) როგორც ჩანს, აქვთ „მასტერ რეგულატორები“?NMP მოდულირებს მრავალფეროვან უჯრედულ პროტეინს, რათა დაარეგულიროს ან აღმოფხვრას მათი ქვედა დინების აქტივობები, რითაც თამაშობს როლს მრავალფეროვან ბიოლოგიურ პროცესებში, როგორიცაა უჯრედული სტრესის რეაქცია და რედოქს ჰომეოსტაზი (22, 33).

ამ კვლევაში (სურათები 2 და 4 და SI დანართი, ნახატები S3 და S5), ჩვენ შევძელით დაგვემტკიცებინა, რომ nsp12-მა გადასცა UMP (NMP) ნაწილი ერთ (შენახულ) პოზიციაზე nsp9-ში, ხოლო სხვა ცილები არ შეცვლილა გამოიყენება პირობებში, კარგად განსაზღვრული (და არა ფხვიერი) სუბსტრატის სპეციფიკა მხარდაჭერილია.ამის შესაბამისად, N-ტერმინალურ nsp9 NMPylation-თან შედარებით, nsp12-ის საკუთარი NMPylation აქტივობა ძალიან დაბალია, მისი აღმოჩენა მოითხოვს ავტორადიოგრაფიის ექსპოზიციის უფრო მეტ დროს და გამოიყენება nsp12 კონცენტრაციის 10-ჯერ გაზრდა.გარდა ამისა, ჩვენმა MS ანალიზმა ვერ მოგვაწოდა მტკიცებულება nsp12-ის NMPylation-ზე, რაც ვარაუდობს, რომ NiRAN დომენის თვით-NMPylation არის (საუკეთესო შემთხვევაში) მეორადი აქტივობა.თუმცა, უნდა აღინიშნოს, რომ სხვა კვლევებმა მოიპოვა წინასწარი მტკიცებულება იმისა, რომ ბაქტერიული NMPylator-ის თვითამპილირების სტატუსი შეიძლება აკონტროლოს მათი NMPylation აქტივობა სხვა ცილის სუბსტრატებზე (22, 33).ამიტომ, საჭიროა მეტი კვლევა თვით-NMPylation აქტივობების შესაძლო ფუნქციური ეფექტების გამოსაკვლევად, მოხსენებული EAV nsp9 (16) და კორონავირუსის nsp12 (ეს კვლევა), მათ შორის შემოთავაზებული ჩაპერონის მსგავსი ეფექტი C-ტერმინალური RdRp დომენის დაკეცვაზე ( 16)).

ადრე განხილული იყო რამდენიმე ჰიპოთეზა ნიდოვირუსული NiRAN დომენის შესაძლო ქვედა დინების ფუნქციებთან დაკავშირებით, მათ შორის რნმ ლიგაზა, რნმ-დახურული გუანილატ ტრანსფერაზა და ცილის პრაიმინგის აქტივობა (16), მაგრამ არცერთი მათგანი არ არის თავსებადი ხელმისაწვდომ ქვედა დინების ფუნქციებთან.შემდეგ პოზიციებზე მიღებული ინფორმაცია ზუსტად იგივე დროა დამატებითი ვარაუდების გაკეთების გარეშე.ამ კვლევაში მიღებული მონაცემები ყველაზე მეტად შეესაბამება (მაგრამ ვერ ამტკიცებს), რომ NiRAN დომენი მონაწილეობს ცილებით გამოწვეული რნმ-ის სინთეზის დაწყებაში.ადრე ითვლებოდა, რომ NiRAN დომენის ფუნქცია 5??²-რნმ-ის დაფარვის ან რნმ-ის ლიგაციის რეაქციებზე გავლენას არ ახდენს ეს და სხვა მონაცემები.ამიტომ, მაგალითად, მიჩნეულია, რომ NiRAN-ის აქტიური ადგილი მოიცავს კონსერვაციულ Asp-ს, როგორც ზოგად ბაზას (D252 Pseudomonas syringae SelO-ში; D4271 HCoV-229E pp1ab; D208 SARS-CoV-2 nsp12-ში) (SI დანართი, სურათი 2 ).S2) (17, 22, 33), ხოლო ATP-დამოკიდებულ რნმ ლიგაზასა და რნმ-ის დაფარვის ფერმენტში კატალიზი ხორციელდება კოვალენტური ფერმენტის-(ლიზილ-N)-NMP შუალედური ნივთიერებით, რომელიც მოიცავს არაშეცვლილ Lys-ის ნარჩენს ( 41).გარდა ამისა, კორონავირუსის NiRAN-ის შესანიშნავი თანმიმდევრობაზე დაფუძნებული სპეციფიკა კონსერვაციული ცილის სამიზნეებისთვის და მოდუნებული სპეციფიკა NTP-ის თანა-სუბსტრატებისთვის (უპირატესად UTP) ეწინააღმდეგება NiRAN-ის შუამავლობით დაფარვის ფერმენტს ან რნმ ლიგაზას მსგავს ფუნქციებს.

ცხადია, ბევრი დამატებითი სამუშაოა საჭირო იმისათვის, რომ გადაამოწმოს და, თუ დადასტურდება, განიხილოს nsp9-UMP (nsp9-NMP) შესაძლო როლი ცილებით გამოწვეული რნმ-ის სინთეზში, რომელიც დააკავშირებს რამდენიმე საინტერესო, მაგრამ (ჯერჯერობით) ადრე მოხსენებულ ანგარიშებს. .იზოლირებული დაკვირვებები.მაგალითად, დადგინდა, რომ კორონავირუსის უარყოფითი ჯაჭვის რნმ-ის დასასრული იწყება ოლიგო(U) ჯაჭვით (42, 43).ეს დაკვირვება შეესაბამება იმ აზრს, რომ უარყოფითი ჯაჭვის რნმ-ის სინთეზი დაწყებულია nsp9-ის UMPylated ფორმის შეკავშირებით პოლი(A) კუდთან (ტრიგერები), რაც შეიძლება ხელი შეუწყოს მის რნმ-ს შეკავშირებას. აქტივობა და/ან ურთიერთქმედება სხვა RTC ცილა.nsp9-ის მიერ მოწოდებული UMP ნაწილი შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც „პრაიმერი“ nsp7/8/nsp12 შუამავლობით გამოწვეული ოლიგოურიდილაციისთვის, 3??²-პოლი(A) კუდის გამოყენებით გენომიურ რნმ-ში ან სხვა ოლიგოს (A) შემცველი თანმიმდევრობით. ემსახურება როგორც შაბლონს, პიკორნავირუსის VPg ცილისთვის დადგენილი მექანიზმის მსგავსი (44).რა მოხდება, თუ წინადადება არის „არანორმატიული“????(ცილებით გამოწვეული) ნეგატიური ჯაჭვის რნმ-ის სინთეზის დაწყება იძლევა კავშირს დაკვირვებებთან, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ კოროვირუსის უარყოფით ჯაჭვის რნმ-ს აქვს UMP (ნაცვლად UTP) ბოლოში (42), რაც მიჩნეულია, რომ მიუთითებს, რომ ნუკლეინის მჟავა Dicer წყვეტს ფოსფორილირებულ ბოლოს უცნობი ურიდინისთვის სპეციფიკური ენდონუკლეაზას მიერ.თუ დადასტურდა, ეს ნუკლეინის მჟავა ჰიდროლიზური აქტივობა შეიძლება დაეხმაროს nsp9-ის ოლიგომერული UMPylated ფორმის განთავისუფლებას ახალშობილი უარყოფითი ძაფის 5 ² ბოლოდან.nsp9-ის შესაძლო როლი ცილის პრაიმინგში ასევე შეესაბამება წინა საპირისპირო გენეტიკური კვლევებს, რომლებმაც აჩვენეს, რომ nsp9 (და nsp8) ურთიერთქმედებს კრიტიკულად და კონკრეტულად კონსერვაციულ ცის მოქმედ რნმ ელემენტთან, კოროვირუსის გენომის მე-3 ბოლოსთან.45).ამ მოხსენების თანახმად, ეს წინა დაკვირვებები ახლა შეიძლება ხელახლა განიხილებოდეს და გაფართოვდეს შემდგომი კვლევის გზით.

მოკლედ, ჩვენმა მონაცემებმა განსაზღვრა საკუთრებაში არსებული ვირუსის ფერმენტის ტეგის სპეციფიკური აქტივობა, რომელიც დაკავშირებულია RdRp-თან N-ბოლოზე.კორონავირუსში, ეს ახლად აღმოჩენილი NiRAN-ის შუამავლობით UMPylator/NMPylator აქტივობა გამოიყენება Mn2+ და მიმდებარე Asn-ის ნარჩენების დასაყრდენად და იწვევს (დაბალენერგიულ) ფოსფორამიდატის ბმების წარმოქმნას N-ტერმინალურ პირველად ამინთან.nsp8|9 გაყოფის ადგილზე Mpro შუამავლობით გაყოფის გზით, nsp9 სამიზნე შეიძლება გამოყენებულ იქნას NMPylation-ისთვის, რაც მიუთითებს პროტეაზასა და NiRAN დომენს შორის ფუნქციურ დაწყვილებაზე, რომელიც ვრცელდება RdRp-მდე.ძირითადი ნარჩენების კონსერვაცია nsp12 NiRAN აქტიურ ადგილზე და nsp9 სამიზნე, კომბინირებული ორი კოროვირუსისგან მიღებული მონაცემებით, მათ შორის SARS-CoV-2, იძლევა ძლიერ მტკიცებულებას, რომ nsp9 NMPylation არის კორონავირუსი.არსებული მონაცემები მიგვიყვანს დასკვნამდე, რომ nsp9-ის NMPylated ფორმის სპეციფიური როლი ცილებით გამოწვეული რნმ-ის სინთეზში არის გონივრული სცენარი კოროვირუსისა და სხვა ჩადგმული ვირუსებისთვის, და NiRAN-მა შეიძლება ასევე მიმართოს სხვა ამოუცნობ ცილებს.არეგულირებს ვირუსს.მასპინძლის ურთიერთქმედება.თუ დადასტურდება, ცილის პრაიმერების ჩართვა ვირუსული რნმ-ის სინთეზში გაზრდის Mpro/3CLpro და RdRp დომენების თანმიმდევრულ აფინურობას ადრე გამოვლენილ კორონავირებსა და პიკორნავირუსის მსგავს სუპერჯგუფს შორის (9), რომლებიც ახლა გაერთიანებულია ახლახან დაარსებულ პისონივირიტებში ( 46) კატეგორიაში.

ჩვენი მონაცემები ასევე აჩვენებს, რომ ამ კვლევაში გამოვლენილი ძირითადი, შერჩევითი და კონსერვატიული ფერმენტული აქტივობები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ანტივირუსული პრეპარატების სამიზნედ.ნაერთები, რომლებიც ხელს უშლიან კონსერვირებული nsp9 N-ტერმინალის შეკავშირებას (და შემდგომ მოდიფიკაციას) NiRAN-ის აქტიურ ადგილზე, შეიძლება ჩამოყალიბდეს ეფექტურ და მრავალმხრივ ანტივირუსულ საშუალებებად, რომლებიც შესაფერისია სხვადასხვა (ქვე) გვარის ინფექციების ცხოველთა და ადამიანის კოროვირუსების სამკურნალოდ. , მათ შორის SARS-CoV-2 და ახლო აღმოსავლეთის რესპირატორული სინდრომის კორონავირუსი.

ამ კვლევაში წარმოებული კორონავირუსის პროტეინის კოდირების თანმიმდევრობა გაძლიერდა RT-PCR-ით, რნმ-ის გამოყენებით, რომელიც იზოლირებულია Huh-7-დან HCoV-229E-ით ან Vero E6-ით ინფიცირებული SARS-CoV-2-ით და ჩასმული კლონირების სტანდარტული პროცედურების გამოყენებით.pMAL-c2 (ახალი ინგლისის ბიოლოგიური ლაბორატორია) ან pASK3-Ub-CHis6 (47) ექსპრესიის ვექტორი (SI დანართი, ცხრილები S1 და S2).ერთჯერადი კოდონის ჩანაცვლება დაინერგა PCR-ზე დაფუძნებული ადგილზე მიმართული მუტაგენეზით (48).MBP შერწყმა პროტეინის წარმოებისთვის, E. coli TB1 უჯრედები ტრანსფორმირდა შესაბამისი pMAL-c2 პლაზმიდური კონსტრუქციით (SI დანართი, ცხრილი S1).შერწყმული ცილა გაიწმინდა ამილოზის აფინურობითი ქრომატოგრაფიით და დაიშალა Xa ფაქტორით.შემდგომში, C-ტერმინალის His6-ით მონიშნული ცილა გაიწმინდა Ni-იმობილიზებული ლითონის აფინურობის ქრომატოგრაფიით (Ni-IMAC), როგორც ადრე იყო აღწერილი (49).უბიკვიტინის შერწყმა პროტეინის წარმოებისთვის E. coli TB1 უჯრედებმა გამოიყენეს შესაბამისი pASK3-Ub-CHis6 პლაზმიდური კონსტრუქცია (SI დანართი, ცხრილები S1 და S2) და pCGI პლაზმიდური დნმ, რომელიც აკოდირებს უბიკვიტინის სპეციფიკურ C-ტერმინალურ ჰიდროლაზას 1 (Ubp1).ტრანსფორმაცია (47).C-ტერმინალის His6-ით მონიშნული კორონავირუსის ცილა გაწმენდილი იყო, როგორც ადრე იყო აღწერილი (50).

HCoV-229E nsp12-His6-ის თვით-NMPylation ტესტი ჩატარდა, როგორც აღწერილია EAV nsp9-ში (16).მოკლედ, nsp12-His6 (0.5 μM) შეიცავს 50 მმ 4-(2-ჰიდროქსიეთილის)-1-პიპერაზინეეთანსულფონის მჟავას (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 მმ დითიოთრეიტოლს (DTT), 6 მმ MnCl2, 25 μM ბუფერს. მითითებული NTP და 0.17 μM ემთხვევა [α32-P]NTP (3000 Ci/მმოლი; Hartmann Analytic) 30 °C-ზე 30 წუთის განმავლობაში.ყველა სხვა (სტანდარტულ) NMPylation ანალიზში nsp12 შუამავლობით nsp9 NMPylation, რეაქციის პირობები მორგებულია შემდეგნაირად: nsp12-His6 (0.05 μM) და nsp9-His6 (4 μM) 50 მმ HEPES-KOH (pH 8.0) თანდასწრებით. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM მითითებული NTP და 0.17 μM შესატყვისი [α32-P]NTP.30°C-ზე 10 წუთის ინკუბაციის შემდეგ, რეაქციის ნიმუში შერეული იყო SDS-PAGE ნიმუშის ბუფერთან: 62,5 მმ ტრის(ჰიდროქსიმეთილ)ამინომეთანის HCl (pH 6,8), 100 მმ DTT, 2,5% SDS, 10% გლიცეროლი და 0,0005% ბრომოფენოლი. ლურჯი.ცილა დენატურირებული იყო 90 °C-ზე გაცხელებით 5 წუთის განმავლობაში და გამოეყო 12% SDS-PAGE-ით.გელი ფიქსირდება და შეღებილია Coomassie Brilliant Blue ხსნარით (40% მეთანოლი, 10% ძმარმჟავა, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), გაუფერულდება და ექვემდებარება ფოსფორესცენტურ გამოსახულების ეკრანს 20 საათის განმავლობაში (nsp12 NMPylation-ისგან გამოსავლენად) ან (მაქსიმუმ) 2 საათი (nsp9 NMPylation-ის შესაფასებლად).Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) გამოიყენებოდა ეკრანის სკანირებისთვის და ImageJ გამოიყენებოდა სიგნალის ინტენსივობის გასაანალიზებლად.

MS ანალიზისთვის, 1 μM nsp12-His6 და 10 μM nsp9 (ჰექსაჰისტიდინის ტეგის გარეშე) გამოყენებული იყო NMPylation ანალიზში (SI დანართი, ცხრილი S1) და გამოყენებული იყო 500 μM UTP და GTP გაზრდილი კონცენტრაცია.მათი კონცენტრაციისა და ცილის მოსალოდნელი ხარისხის მიხედვით, Waters ACQUITY H- კლასის HPLC სისტემა, რომელიც აღჭურვილი იყო MassPrep სვეტით (Waters) გამოიყენებოდა 1-დან 10 μL ბუფერული ცილის ხსნარების ონლაინ დემარილის მოსაშორებლად.მარილიანი ცილა გამოირეცხება Synapt G2Si მასის სპექტრომეტრის ელექტროსპრეის იონურ წყაროში (წყლები) ბუფერი A (წყალი/0,05% ჭინჭრის მჟავა) და ბუფერი B (აცეტონიტრილი/0,045% ჭინჭრის მჟავა) შემდეგი გრადიენტის მეშვეობით და სვეტის ტემპერატურა არის 60 ° C და ნაკადის სიჩქარე 0,1 მლ/წთ: გამორეცხვა იზოკრატიულად 5% A 2 წუთის განმავლობაში, შემდეგ ხაზოვანი გრადიენტი 95% B-მდე 8 წუთის განმავლობაში და შეინარჩუნეთ 95% B კიდევ 4 წუთის განმავლობაში.

გამოვლენილია დადებითი იონები, რომელთა მასის დიაპაზონი 500-დან 5000 მ/ზ-მდეა.გლუ-ფიბრინოპეპტიდი B იზომება ყოველ 45 წამში მასის დრეიფის ავტომატური კორექტირებისთვის.გამოიყენეთ MassLynx ინსტრუმენტების პროგრამული უზრუნველყოფა MaxEnt1 გაფართოებით საშუალო სპექტრის გასაუქმებლად საბაზისო ხაზის გამოკლებისა და გასწორების შემდეგ.

UMPylated HCoV-229E nsp9 დაიჯესტირდა თანმიმდევრობის ხარისხის მოდიფიცირებული ტრიპსინის (Serva) დამატებით და ინკუბირებული იყო ღამით 37 °C-ზე.Chromabond C18WP დაწნული სვეტი (ნაწილის ნომერი 730522; Macherey-Nagel) გამოიყენებოდა პეპტიდების მარილისა და კონცენტრირებისთვის.საბოლოოდ, პეპტიდი იხსნება 25 μL წყალში, რომელიც შეიცავდა 5% აცეტონიტრილს და 0,1% ჭიანჭველას.

ნიმუშები გაანალიზდა MS-ით Orbitrap Velos Pro მასის სპექტრომეტრის (Thermo Scientific) გამოყენებით.საბოლოო nanoâ HPLC სისტემა (Dionex), რომელიც აღჭურვილია საბაჟო ბოლოში დამონტაჟებული 50 სმ??75 მკმ C18 RP სვეტი შეფუთული 2,4 მკმ მაგნიტური მძივებით (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) დაუკავშირდით მასის სპექტრომეტრს ონლაინ Proxeon ნანოსპრეის წყაროს მეშვეობით;შეიტანეთ 6 μL ტრიპსინის საჭმლის მომნელებელი ხსნარი 300 μm შიდა დიამეტრის ×??1 სმ C18 PepMap წინასწარი კონცენტრაციის სვეტი (Thermo Scientific).გამხსნელად წყლის/0.05% ჭიანჭველა მჟავის გამოყენებით, ნიმუში ავტომატურად იკვებება და დემარილდება 6 μL/წთ სიჩქარით.

შემდეგი გრადიენტები წყალი/0,05% ჭიანჭველა (გამხსნელი A) და 80% აცეტონიტრილი/0,045% ჭიანჭველა (გამხსნელი B) გამოყენებული იქნა ტრიპტური პეპტიდების გამოყოფის მისაღწევად 300 ნლ/წთ: 4% B for 5 წუთი, შემდეგ 30 A ხაზოვანი გრადიენტი 45% B-მდე წუთში და ხაზოვანი ზრდა 95% გამხსნელ B-მდე 5 წუთში.შეაერთეთ ქრომატოგრაფიული სვეტი უჟანგავი ფოლადის ნანოემიტერთან (Proxeon) და შეასხურეთ ელუენტი პირდაპირ მასსპექტრომეტრის გაცხელებულ კაპილარზე 2300 ვ პოტენციალის გამოყენებით. ორბიტრაპის მასის ანალიზატორში 60000 გარჩევადობით კვლევის სკანირება დაკავშირებულია. მინიმუმ სამი მონაცემების MS/MS სკანირებით, დინამიურად გამორიცხული 30 წამის განმავლობაში, ხაზოვანი იონების ხაფანგის შეჯახებით გამოწვეული დისოციაციის ან უფრო მაღალი ენერგიის შეჯახების დისოციაციის გამოყენებით ორბიტაპის გამოვლენასთან ერთად, გარჩევადობა არის 7,500.


გამოქვეყნების დრო: აგვისტო-03-2021